在过去十年中，抗体药物偶联物（ADCs）的发展为提高细胞毒性药物的疗效和降低毒性带来了希望，与传统细胞毒性化疗药物相比具有显著临床优势。ADCs将单克隆抗体的精准靶向性、特异性和细胞毒性化疗药物的强大杀伤力相结合，其核心理念是通过最小化系统毒性来拓宽药物的治疗指数。一般来说，ADC的结构组成包括一个靶向肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体，以及通过连接子连接到抗体上的多个细胞毒性分子（也称为载荷）。
当ADC进入血液循环后，它会选择性地结合到肿瘤细胞表面表达的受体上。随后，受体-ADC复合物通过内吞作用被内化。在肿瘤中，连接子被切割，细胞毒性载荷被释放，游离的载荷通过其作用机制诱导细胞死亡。很多人认为，ADC设计的关键因素主要集中在抗体的选择上，因为抗体是将细胞毒性药物递送至肿瘤的载体。
有趣的是，尽管抗体的选择很重要，但ADC的连接子稳定性以及载荷的选择可能对临床成功更为关键。一个很好的例子是用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的两种ADC药物：德曲妥珠单抗（ENHERTU）和恩美曲妥珠单抗（KADCYLA）。在一项三期研究中，研究者比较了德曲妥珠单抗与恩美曲妥珠单抗在既往接受过曲妥珠单抗和紫杉类治疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者中的疗效，主要终点是无进展生存期。尽管两种ADC药物使用了相同的抗体，但接受德曲妥珠单抗治疗的患者疾病进展或死亡的风险显著低于接受恩美曲妥珠单抗治疗的患者。在524名随机分配的患者中，12个月时无疾病进展且存活的患者比例在德曲妥珠单抗组为75.8%，而在恩美曲妥珠单抗组为34.1%。两种ADC采用的同一抗体，差异主要在连接子和载荷方面（如下表示例所示）。
这些结果突显了在ADC开发早期阶段选择最合适的载荷分子（以及连接子设计）的重要性。这一理念在当前ADC竞争激烈的环境中尤为重要。许多ADC药物在临床开发过程中因毒性过大而失败，包括血液学、肝脏、神经学和眼部事件等，这些毒性削弱了药物的获益-风险比。实际上，许多已获批的ADC药物仍有一定比例的患者因ADC相关毒性需要减少剂量、暂停治疗或停止治疗。
ADC本质上是通过携带的载荷杀伤癌细胞，载荷的选择就显得尤为重要。在ADC药物发展的早期阶段，载荷以传统的化疗药物如甲氨蝶呤、长春碱和阿霉素等细胞毒性药物为主。然而，由于这类ADC药物对癌细胞的细胞毒性效力不足以及在肿瘤细胞内的蓄积量低，导致疗效一般，临床试验陆续失败。研究显示，经静脉给药后，只有大约1%到2%的ADC分子能够到达目标肿瘤部位。这就要求载荷需要具有很高的活性（IC50值处于低纳摩尔和皮摩尔水平）。
目前，已获批ADC药物的载荷主要有两大类高活细胞毒性药物：抗微管药物（例如奥瑞他汀类和美登素类）以及造成DNA损伤的药物（例如喜树碱类、卡利霉素类和吡咯并苯二氮䓬类）
微管是细胞骨架的主要组成部分，在细胞分裂过程中发挥着关键作用，尤其是在肿瘤细胞快速增殖期间。微管蛋白抑制剂可分为两类：微管聚合促进剂和微管聚合抑制剂。这两类分子均是通过干扰微管依赖的有丝分裂发挥作用。
奥瑞他汀（Auristatin）是一种合成的抗肿瘤药物，源自天然产物dolastatin 10。Dolastatin 10本身是一种非特异性毒性药物，因此不被用作ADC载荷。然而，其结构类似物如单甲基奥瑞他汀E（MMAE）通过阻断微管聚合过程，导致细胞周期停滞，已在ADC中大量使用。例如，已上市ADC产品Adcetris的细胞毒性载荷就是MMAE，用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。
美登素类（Maytansinoids）通过阻止微管二聚体聚合形成成熟微管来抑制有丝分裂和细胞复制。美登素类是从灌木Maytenus serrata中分离出来的天然产物，目前有两种美登素衍生物DM1和DM4被用于ADC设计。其中，DM1是用于治疗HER2扩增型乳腺癌的ADC药物Kadcyla的弹头。
顾名思义，DNA损伤剂是一类能够对DNA分子造成损伤的化合物，通过干扰DNA的正常结构和功能，从而抑制细胞增殖、诱导细胞周期停滞或细胞凋亡。严格意义上讲，虽然微管破坏剂主要通过干扰微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂，但它们也可以间接导致DNA损伤，算是DNA损伤剂的一种。除此以外，还有两类主要的DNA损伤剂：一类是拓扑异构酶I抑制剂（Topoisomerase I Inhibitors），通过干扰DNA的拓扑结构，阻止DNA复制和转录，从而诱导细胞凋亡。目前，大多数拓扑异构酶I抑制剂是喜树碱（camptothecin）的衍生物，包括拓扑替康（Topotecan）、司他曲安（Govitecan）、SN-38、Exatecan 和 Deruxtecan 等。例如，Enhertu是一种获批用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌的ADC药物，载荷用的就是拓扑异构酶I抑制剂。
另外一类DNA损伤剂是吡咯并苯二氮䓬类（Pyrrolobenzodiazepines, PBDs），一类从天然产物安曲霉素（anthramycin）衍生而来的DNA损伤剂。它们通过结合DNA小沟中的5′-嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列，并与鸟嘌呤的外环氨基形成共价键，从而干扰DNA的正常功能。比如Tesirine（SG3199）和 Talirine 等PBDs因其高细胞毒性而被用作ADC的载荷。已上市ADC药物Zylonta载荷就是PBD。卡利霉素类（Calicheamicins）也是一类DNA损伤剂，通过结合DNA小沟，诱导双链DNA断裂，从而导致细胞死亡。例如，N-乙酰-γ-卡利霉素被用于Mylotarg和Besponsa等ADC药物的载荷。
ADC的不良反应通常包括靶向作用相关的不良反应和非靶向作用相关的不良反应，其中非靶向作用相关的不良反应是决定其最大耐受剂量的主要因素。既然是非靶向作用，这些剂量限制性毒性往往与靶向的抗原和/或治疗的癌症类型无关，常常限制了ADC的剂量，使其低于能够实现最佳抗癌效果的剂量。细胞毒性药物的低皮摩尔级活性是导致ADC不良反应的重要因素，因此仅靠细胞毒性药物的活性，可能很难实现远高于1的治疗指数。因此，除了具有极高的活性外，ADC的药物载荷还必须具备适当的药物代谢和药代动力学（DMPK）特性。
DMPK是药物发现过程中的重要组成部分。在过去十年中，对药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）以及药代动力学（PK）特性的理解，已经从描述性研究转变为定量和机制方面的理解，以了解药物在体内的过程。对于传统的口服小分子药物而言，DMPK科学家主要关注两个方面：化合物是否具有生物药剂学上合适的、可成药的药代动力学特性，以及化合物是否具有可能在临床中引发安全问题的特性。为此，清除率和生物利用度是前者的关键特征，而药物相互作用（DDIs）和代谢相关的特异性药物反应（生物活化）则是后者的首要考虑因素。在这种背景下，可以尝试将ADC药物载荷的开发重点与用于口服给药的小分子药物进行对比。
对于口服小分子药物候选物需具有可接受的生物利用度。因此，在药物发现过程中，药物候选物在水性介质中的溶解性是需要优化的关键理化性质之一。一般来说，候选药物需要具有高于10μM的溶解度，才能进行临床前测试。此外，低溶解度分子的口服生物利用度通常变异比较大，且往往剂量/暴露量之间不成比例，通常需要进行制剂配方优化。
不过，ADC毕竟是静脉给药，看似不涉及口服生物利用度这一问题。尽管口服吸收与ADC药物载荷无关，但仍需了解候选载荷的几个基本特性：大小、极性、亲脂性和构象动力学。这些理化性质很重要，因为药物载荷需要具有适合大规模偶联到抗体的功能基团。比如许多高活性小分子药物，缺乏所需的化学功能基团用于偶联，如果这类载荷进行修改，引入这些“反应基团”，可能会对药物载荷的活性产生不利影响。此外，除了需要具备“反应基团”外，候选载荷还必须具有足够的溶解性，因为抗体偶联过程是在水性环境中进行的。为什么不在有机溶剂中呢？因为，偶联反应中过度暴露于有机溶剂可能会使抗体变性，导致蛋白质构象变化和聚集，从而导致ADC功能丧失，并可能增加免疫原性风险。
一般来说，小分子药物穿过脂质生物膜的能力是决定其ADME属性的关键，影响生物利用度（如穿过胃肠道上皮）或药理学特性（如穿透器官屏障），决定药物能够发挥预期的治疗效果。因此，药物的亲脂性（描述化合物在水相和脂相之间分配的指标）是药物发现过程中需考察的基本理化性质指标。对于口服给药的分子来说，渗透性是一个关键的指标，与分子口服生物利用度高低直接有关。尽管口服生物利用度对于ADC的药物载荷来说并不是一个重要考虑因素，但高渗透性这一特性仍然需要关注。因为，一些药物载荷在被内吞并杀伤肿瘤细胞后，会从最初的肿瘤细胞中逸出，并穿过邻近肿瘤细胞的细胞膜，发挥“旁观者效应”，形成不依赖TAA的肿瘤杀伤。这种杀伤效果的强弱对载荷的细胞膜渗透性就有比较高的要求。李等人（Li and others）研究了药物载荷旁观者效应对ADC疗效的药理学作用，比较了两种ADC的体内活性，这两种ADC具有相同的抗体和连接子，但药物载荷不同（MMAE和MMAF）。在这项研究中，渗透性更好的MMAE展示了对邻近肿瘤细胞的强烈旁观者杀伤作用，而膜渗透性较差的药物载荷MMAF未能在体内介导旁观者杀伤。
另一个支持ADC载荷选择的关键指标之一是未结合药物的清除速率。一般来说，药物在进入体内后，需要到达作用部位才能发挥其药理学效应。然而，如果药物的PK特性不理想（如高清除率和/或短半衰期），那么该分子可能无法实现预期的药效学（PD）效应。一般来说，大多数脂溶性药物首先在肝脏中被代谢，然后才能被排泄。药物的代谢可以分为I相（修饰）和II相（结合）。I相反应通过氧化、还原、水解等方式改变脂溶性药物的化学结构，使其成为更具极性的分子，通常是通过移除氢原子或添加氧原子来实现。细胞色素P450酶家族负责这些I相反应的大部分过程。利用人和动物肝脏进行的体外代谢研究，以及在临床前种属中进行的体内代谢研究，是识别药物代谢途径的主要方法。通常认为，苯甲基C-H键、烯丙基甲基和O-、N-、S-甲基基团是P450介导的药物氧化反应的敏感代谢位点。对于II相代谢，药物通过结合反应与另一分子结合，产生一种药理学上无活性且有一定水溶性的化合物，从而更容易排泄。结合机制包括甲基化、乙酰化、硫酸化、葡萄糖醛酸化以及甘氨酸或谷胱甘肽结合。
小分子药物代谢的原理与ADC载荷的代谢完全相同。不过，从ADC释放的载荷不会像口服小分子药物那样经历首过消除。当然，ADC载荷会被药物代谢酶处理，并在未结合载荷消除过程中发挥重要作用。因此，除了了解载荷发生了哪些化学修饰外，还需要确定哪些药物代谢酶促进了载荷的消除。在载荷选择过程中，进行肝药酶表型研究可以帮助识别参与载荷代谢的特定酶。这些表型研究的结果可以支持后续的DDI研究。而且，ADC细胞毒性载荷的剂量反应关系陡峭和治疗指数狭窄，这一试验结果就显得尤为重要。毕竟，多药联用以及老年肿瘤患者合并其它用药，潜在的DDI风险，可能会导致载荷系统暴露量的变化，并可能在某些个体中导致严重甚至危及生命的毒性。比如ADC载荷SN-38，其常见的严重毒性包括中性粒细胞减少症和腹泻。在人体中，SN-38的消除主要通过UDP葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A1）将药物结合成β-葡萄糖醛酸苷结合物SN-38G来实现。在临床中，由于UGT1A1个体间基因多态性，SN-38的葡萄糖醛酸化程度存在很大差异，其中具有UGT1A1*28多态性的患者对SN-38的葡萄糖醛酸化能力降低，从而导致更高的SN-38暴露量。另外，UGT活性的降低与伊立替康（SN-38的前药）观察到的毒性风险增加有关。
虽然载荷的肝脏代谢表征比较重要，但成功的ADC载荷还要关注在肿瘤中的稳定性。毕竟，载荷毒素的药理学靶点在肿瘤细胞内，因此载荷在释放到细胞内后必须能够抵抗降解及随后的失活，以保持生化环境中的稳定。例如，酸敏感载荷在溶酶体中不稳定，而含有二硫键、烯烃或环氧化物等功能基团的载荷可能被酶还原或转化，从而影响载荷向其使命终点的递送。ADC的体内生命周期通常是这样的，首先被静脉注射进入系统循环，之后识别肿瘤细胞表面表达的目标抗原，并随后形成抗原-ADC复合物。接下来，整个抗原-ADC复合物通过形成有被小窝并进一步发展为早期内体，内化进入细胞内。之后，一部分ADC与FcRn结合，并被反向转运回到细胞外。剩余的抗原-ADC复合物经历早期内体成熟为晚期内体，之后与溶酶体融合，并将ADC运输到降解部位，从而释放载荷。溶酶体通过H+ -ATPase持续输入质子，维持pH值在4.5到5.0之间的酸性环境，并且还含有高浓度的蛋白水解酶，如组织蛋白酶和胶原酶。释放或游离的载荷必须成功地通过内体/溶酶体的考验，才能发挥其预期的药理学效应。
ADC在实体瘤和血液瘤的全面开花，吸引了工业界和学术界的广泛关注，并开始设计下一代ADC。下一代ADC主要围绕三个核心组成部分展开，即抗体、连接子和载荷。载荷方面，两类非细胞毒性治疗药物——蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）和小干扰核糖核酸（siRNAs）——似乎是理想的ADC载荷。
PROTACs是由针对目标蛋白（POI）的配体部分通过化学连接子与E3泛素连接酶配体连接而成的双功能化合物。这些分子的药理作用机制依赖于它们将POI和E3连接酶拉近到足够近的距离，从而触发POI的定向多泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解。尽管PROTACs是高效的降解剂，但通常不具备组织特异性。因此，通过安装一种增强组织特异性PROTAC降解的手段（例如ADC），可以减少PROTACs的副作用，优化临床治疗窗口，从而增强其在癌症治疗中的潜力。当然，抗体与分子胶偶联也能达到类似目的。这个领域已经产生了不少的交易。2023年9月7日，Seagen与Nurix签订一项合作协议，共同开发抗体偶联降解剂（Degrader-Antibody Conjugates，DAC），Nurix将获得6000万美元的预付款，并有可能获得高达约34亿美元的多个项目的研究、开发、监管和商业里程碑付款。2023年11月，Orum公司宣布与BMS签署了一项协议，BMS以1亿美元预付款收购了Orum的靶向蛋白降解剂ORM-6151，并有望获得总交易价值约1.8亿美元的里程碑付款。2023年12月12日，C4 Therapeutics宣布与默沙东签订协议，共同开发DAC。作为合作的一部分，C4T将负责开发有效载荷；默沙东将负责抗体偶联，在药物发现阶段创建DAC。C4T将获得1000万美元的预付款；对于合作的首个靶点，C4T有望获得总计约6亿美元的里程碑付款，以及未来销售的分级特许权使用费。此外，默沙东还拥有三个合作项目的扩大选择权，倘若行使权利，C4T将有资格在整个合作中获得高达约25亿美元的潜在付款。
siRNAs是一类属于小非编码核糖核酸（sncRNA）家族的药物，能够通过与mRNA的特异性序列识别来靶向并沉默特定基因表达，例如癌基因、肿瘤抑制基因和其他调控基因。siRNAs存在两点局限性，限制了其成药性。一是大小和高负电荷，使其无法通过被动摄取进入细胞；二是未修饰的siRNAs通常在生理条件下半衰期较短，因为容易被细胞外和细胞内核酸酶快速降解。然而，通过使用选定的连接子和偶联化学将这类分子与靶向大分子结合，生成一种新的ADC设计，可能会增强这类分子的成药性。
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